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抗体的酶符号方法及符号作用测定

抗体的酶符号方法及符号作用测定

发布时间:2020-01-20


1.符号办法 杰出的酶结合物取决于两个条件:即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备符号抗体至关重要,由于特异性免疫反响随抗体活性和纯度的添加而增强。在酶符号过程中,抗体的活性有所下降,故需求纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白,最好运用亲和层析提纯的抗体,可进步敏感性,并且可稀释运用,削减非特异性吸附。
酶与抗体交联,常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥树立的HRP符号抗体的改良过碘酸钠法简单易行,符号作用好,特别适用于实验室的小批量制备。其符号程序为:将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中,参加新鲜制造的0.06 mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml,混匀置4℃冰箱30分钟 , 取出参加0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室温放置30分钟后参加含5(g纯化抗体的水溶液1ml,混匀并装透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中渐渐搅拌透析6小时(或过夜)使之结合,然后吸出,加硼氢化钠(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小时,将上述结合物混合液参加等体积饱满硫酸铵溶液,置4℃冰箱30分钟后离心,将所得沉积物溶于少量0.02mol/L、pH7.4PBS中,并对之透析过夜(4℃),次日离心除掉不溶物,即得到酶标抗体,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,进行测定后,冷冻干燥或低温保存。
2.酶标抗体符号作用测定:测定内容包含酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
(1) 酶与抗体的活性 常用琼脂分散或免疫电泳法,使抗原与抗体构成沉积线,经PBS漂洗1天,再以蒸馏水浸泡1小时,将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色,如果呈现应有的色彩反响,再用生理盐水浸泡,色彩依然不褪,表示结合物既有酶的活性,也有抗体活性。杰出的结合物在显色后,琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定办法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)办法进行方阵滴定,此法不只能够测定符号作用,还能够断定酶标抗体的运用浓度。

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